增加维甲酸通过抑制非典型Notch1信号通路减少涎腺腺样囊性癌肺转移

评语：腺样囊性癌(ACC)是来源于腺体的恶性肿瘤，常发生局部复发、神经周围浸润和远处转移（多见于肺）。肺转移患者长期预后较差，但目前肺转移机制不明，近30年来尚无有效的临床治疗体系。本文重点研究MYB与NOTCH1之间的联系，即MYB在NOTCH1调控的“MYC_TARGETS_V2”基因集之间的通路上起桥梁作用，因此被定义为非经典Notch通路，是肺转移的关键通路之一；并且发现维甲酸(RA)信号是非经典Notch1途径的内在拮抗剂，动物实验证实全反式维甲酸(ATRA)明显抑制肺转移。因此，本研究提示ATRA在减少肺转移方面的临床价值。视黄酸受体(RARs)的缺失或功能障碍可作为ACC患者肺转移的标志或ATRA治疗的指征。

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摘要：

目的：MYB-NFIB融合和NOTCH1突变是唾液腺腺样囊性癌(SACC)常见的标志性遗传事件。然而，在没有MYB-NFIB融合和NOTCH1突变的患者中也观察到MYB和NOTCH1的异常表达。本研究的目的是探索MYB和NOTCH1在ACC肺转移中的分子机制，寻找抑制ACC肺转移的治疗策略。

方法：通过单细胞测序及Seurat聚类识别癌细胞聚丛，进行RNA速率、轨迹和亚聚类分析以深入研究原发性肿瘤中与肺转移相关的癌症祖细胞样细胞簇。染色质免疫共沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ，Co-IP）、Western blot研究MYB、NOTCH1的调控关系，以及体内外药物实验验证对MYB和NOTCH1及肺转移的抑制。通过免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和肿瘤样本的RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）验证表达差异。

结果：Notch信号通路富集在癌细胞聚丛中；与转移可能相关的癌症祖细胞样聚丛特征基因及细胞增殖相关基因通过蛋白-蛋白相互作用分析发现与NOTCH1或MYB有直接相互作用。体外实验表明，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid ，ATRA)、DAPT（γ-分泌酶抑制剂）联合使用优于ATRA 单药或DAPT单药使用。通过Co-IP检测到NICD1-MYB-MYC复合物，并发现NOTCH1异常表达激活维甲酸（Retinoic acid，RA）信号通路进而下调MYB和MYC，且ATRA是“MYC_TARGETS_V2”基因的内源性拮抗剂。体内实验发现 ATRA 给药21天后显著抑制小鼠肺转移。对ACC患者的原发组织和肺转移组织RNA-seq结果发现RARA（维甲酸受体）在肺转移组织中表达明显下调；IHC分析表明，在肺转移灶中NICD1明显上调；而RARα下调。

结论：NOTCH1通过MYB招募激活“MYC_TARGETS_V2”基因集促进ACC肺转移。ATRA纠正MYB过表达和促进NOTCH1的抗癌作用，显著降低ACC的肺转移。这些发现提示RA系统在ACC诊断和治疗中的价值。

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Fig 1e Notch信号通路在癌细胞聚丛中富集

Fig 3b 基于免疫组化染色对34例患者无肺转移时间与MYB或/和NICD1蛋白（NOTCH1活性结构域）水平之间的相关性进行统计分析。结果显示MYB及NICD1阳性表达越高，患者无肺转移时间越短。MYB及NICD1表达双阳性的患者（7例）与仅MYB阳性或仅NICD1表达阳性的患者相比无肺转移时间更短。

Fig 3e不同MYB、NOTCH1敲除细胞株尾静脉注射后转移小鼠肺组织代表性HE图像及肺组织转移数量的统计分析。SACC-LM-double（MYB-NOTCH1）双敲除组肺组织的转移灶明显更少、更小，且具有统计学意义。

Fig 5e 可视化下显示溶剂组、DAPT（10mg/kg）、ATRA（10mg/kg）、ATRA（5mg/kg）、DAPT 联合ATRA（10mg/kg+5mg/kg），第1天、14天、21天小鼠肺部荧光图像。 结果表明与DAPT单用、两药联合给药相比，ATRA单用治疗效果最好。

Fig 7d 通过5例肺转移组织及配对癌旁组织的RNA-seq分析，结果发现RARA（维甲酸受体）在肺转移组织中表达明显下调。

Fig 8b免疫组化分析：在9例原发ACC和28例肺转移及各自配对癌旁组织中检测MYB、NICD1、RARs、NPM1、PRMT3、FABP7的表达，发现与癌旁组织相比，MYB、NICD1和RARγ在原发灶中显著上调；在肺转移灶中，与癌旁组织相比，NICD1和RARγ明显上调。同RNA-seq数据相一致，RARα在肺转移组织中下调。

本文来于Experimental & Molecular Medicine

全文链接：https://doi.org/10.1038/s12276-023-00957-7